聚合酶链式反应

聚合酶链式反应(PCR)是一种基本的分子生物学技术，可*扩增和量化*水平的核酸，目前用于多种应用，包括SNP鉴定、基因分型、传染病鉴定、遗传指纹图谱、DNA测序和克隆，以及基因表达。定量PCR(qPCR)和逆转录(RT-qPCR)以及随后的qPCR是*和定量目标DNA或RNA序列的强大方法。

扩增子纯化和PCR设置，包括主混合物、引物和样品的费力移液组合，可能成为基因组工作流程中的瓶颈。这些过程的自动化可以*与手动处理相关的人为错误和污染，同时确保高质量的结果。

测定小型化时，需要搭配PCR封板膜，这样既*了96孔和384孔qPCR*的成本，并且由先进的反应仪器不需要吸头或与液体接触，因此将交叉污染的风险降至*。此外，亚微升体积的*转移使得无需事先稀释即可添加浓缩样品和试剂。借助为基因组研究量身定制的集成板处理自动化和软件选项，仪器可以轻松扩展以适应生产环境

PCR引物设计

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则

引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增*不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC*随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

引物内部不应出现互补序列。

两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3′端的互补重叠。

引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有*互补序列，否则易导致非特异性扩增。

引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，*选择是G和C。

引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、*标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

模板的制备

PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、*、*等。也可以是病理生理标本如细胞、*、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的*，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经*、氯仿抽提纯化，再用*沉淀后用作PCR反应模板。